2实验材料
紧张试剂
紧张仪器及器材
3蛋白与RNA信息
蛋白信息
蛋白：AGO2
抗体：AGO2 抗体
RNA: TP53
4实验方法
磁珠准备：
1) 取30ul Protein A/G磁珠到1.5ml离心管；于磁力架上静置1min，去上清；并用500ul洗涤液洗涤3遍。
2) 用100ul 裂解液重悬磁珠，分别加入10ug目的抗体或IgG；4℃反转孵育2h;
3) 于磁力架上静置1min，去上清；用500ul洗涤液洗涤3遍。
样本处理：
1) 吸除培养基，并用 5 mL/板预冷的 1×PBS洗一次，吸掉PBS；
2) 将细胞放在冰上，置于365nm紫外灯下进行交联，交联韶光 10 min；
3) 网络细胞到1.5ml的离心管子，去上清；
4) 用3倍体积的裂解液裂解细胞（利用前加入蛋白酶抑制剂及终浓度1 mM DTT），冰上放置10min；
5) 4℃ 10000×g离心15min，转移上清到新的1.5ml离心管中；
6) 加入RNase T1 stock 至终浓度1 U/μL；并于22℃孵育10min；
7) 用500ul细胞裂解液重悬抗体-磁珠稠浊物；并4℃翻转孵育3h；
8) 用1mL洗涤液洗涤5遍。
9) 用100ul悬浮磁珠，并加入20U的RNase-free DNase I；于37℃孵育15min;
10) 加入900ul的裂解液，奏乐混匀后置于磁力架上静置3min，然后去上清；
11) 用80ul的裂解液重悬磁珠；
蛋白消化与 RNA 提取
1) Input组补充裂解液至80ul加入8 μL Proteinase K，IP 组加入8 μLProteinase K；
55℃消化 15 min；
2) 向消化后的溶液加入 1 mL Trizol，用力摇匀 15 s 后，加入200 μL 氯仿，再次用力摇匀15 s 后，冰上放置 2 min；
3) 4℃、12000 g 离心 15 min；
4) 转移上清至新的 2 mL 无酶管中，加入等体积的异丙醇及6ug糖原，-80℃过夜沉淀；
5) 4℃、12000 g 离心 10 min；
6) 弃上清，加入 1 mL 75%乙醇（无酶水配制），洗涤沉淀一次；
7) 4℃、8000 g 离心5 min；
8) 小心弃上清，室温晾干 10 min，将乙醇全部挥发；加入 20 μL ddH2O（RNase DNase free），溶解 RNA，-80℃保存备用。
RNA反转录
1）按照下列组分配制RT反应液（反应液制备请在冰上进行）。为了担保反应液配制的准确性，减少分装造成的偏差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，末了加入RNA样品。
2）按如下程序进行反转录：
37℃,15min；85℃，5sec；-20℃保存备用！
3）定量PCR检测
将Mix在4℃下融解，柔柔地高下颠倒混匀并进行短暂离心；冰上配制下表中的反应液
4）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。
5）采取三步法程序进行反应：
5实验结果（详细剖析结果及引物序列见excel:CLIP 检测结果）
a. 抗体验证结果：
a. 柱状图及PCR产物电泳图
4、项目内容
广州准期生物技能有限公司成立于2016年，始终以探索科学、做事客户为己任；致力于为高校、科研院所、医院、制药企业供应全面、便捷、专业的技能做事和产品。技能方面我们专注于生物医学领域：公司拥有完善的技能做事平台，覆盖分子生物学，转录组学、代谢组学、蛋白组学，表不雅观遗传等多个科研平台。在产品方面，自主研究多种类型科研试剂盒20多项，如：COIP、CHIP、RIP等科研检测试剂盒，较之同类型的进口试剂盒，极大的降落了科研本钱。
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