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导读
松果体已经从鱼类的感光器官进化为哺乳动物的神经内分泌器官。本研究整合了来自斑马鱼、大鼠和猴松果体在白天的多个单细胞RNA-seq数据集，以单细胞分辨率对进化转变进行了研究，确定了松果体功能转变的关键成分。经由严格的质量过滤，共产生了22331个细胞。然后，研究者进行比较剖析，以阐明松果体细胞的进化、它们的光敏性、它们在褪黑素产生中的浸染以及这些物种松果体内的旗子暗记传导过程。研究职员剖析确定了斑马鱼、大鼠和猴松果体的不同细胞组成。斑马鱼感光细胞表现出全面的光转导基因表达，而包括转导蛋白（Gngt1、Gnb3和Gngt2）和光敏蛋白（Pdc）在内的特定基因始终存在于哺乳动物松果体细胞中。研究职员创造松果体和视网膜之间的转录相似性，强调了共同的进化和功能路子。与大鼠和猴比较，斑马鱼表现出独特的光相应昼夜节律基因活性。研究职员确定了关键的配体-受体相互浸染，特殊是涉及MDK和PTN，影响跨物种的褪黑素合成。此外，研究职员不雅观察到与褪黑素合成干系的物种特异性GPCR（G蛋白偶联受体）表达及其与视网膜表达的同等性。本研究结果还强调了与松果体进化和功能干系的特异性转录因子（TF）和调控网络。本研究供应了从鱼类到哺乳动物松果体进化的详细剖析。研究职员确定了关键的转录变革和调控，突出了松果体的功能多样性。值得把稳的是，研究职员创造了影响褪黑素合成的主要配体-受体相互浸染，并证明了松果体和视网膜表达之间的相似性。这些见地增强了对松果体在脊椎动物光转导、褪黑素产生和昼夜节律中浸染的理解。
论文ID
原名：Cross-species single-cell landscape of vertebrate pineal gland
译名：脊椎动物松果体的跨物种单细胞图谱
期刊：JOURNAL OF PINEAL RESEARCH
IF：10.3
揭橥韶光：2023年11月
通讯作者：张超，王蒙
通讯作者单位：同济大学生命科学与技能学院，上海交通大学医学院松江研究院
DOI号：10.1111/jpi.12927
实验设计
结果
1 松果体细胞的进化及其光敏能力
松果体在脊椎动物的昼夜节律调节中起着关键浸染。松果体功能的核心是其对环境光旗子暗记的进化适应。七鳃鳗、鱼和两栖动物的松果体表现出直接的光敏性。相反，哺乳动物的松果体依赖视网膜-SCN-SCG-锥神经肾上腺素能通路进行光感知。本研究职员深入研究松果体细胞的进化进程，并以单细胞分辨率探索其在不同物种中的光感能力的繁芜性。
1.1 三个物种松果体细胞组成的特色
为了深入理解松果体细胞的进化，研究职员深入研究了不同物种松果体的细胞组成和转录组学特色。为了实现这一点，研究职员检索了三个物种的已揭橥单细胞数据集。图1A代表了这些物种的进化树和解剖位置示意图。对数据集进行同等的比较，研究职员的剖析紧张依赖于所有物种的单细胞数据，如图1B的流程图所示。
经由严格的质量过滤，研究职员得到了斑马鱼（3549）、大鼠（5050）和猴（13832）的高质量单细胞/单细胞核转录组。利用tSNE聚类和标记基因，研究职员分别在斑马鱼、大鼠和猴中鉴定了9种、6种和7种不同的细胞类型，表明细胞类型的变革（图1C-E）。这些细胞类型聚类图谱与先前的研究同等。在研究职员的剖析中，将斑马鱼杆状和锥状细胞视为斑马鱼的感光细胞，将α-松果体细胞和β-松果体细胞核视为大鼠松果体细胞。此外，研究职员对Müller样神经胶质细胞、RPE样细胞和星形胶质细胞进行了分组，并在随后的剖析中将它们称为支持性神经胶质细胞。值得把稳的是，与哺乳动物的松果体细胞（85%-95%）比较，斑马鱼松果体的感光细胞比例较低（约70%），个中Müller样胶质细胞和RPE样细胞是最丰富的非感光细胞类型。在大鼠和猴中，紧张细胞类型包括松果体细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、血管和软脑膜细胞（VLMC），某些细胞类型是物种特异性的（图1C-E）。这些结果显示了三种脊椎动物不同的细胞身分。
随后，研究职员采取层次聚类剖析来探索种内细胞类型之间的关系（图1F-H）。在这三个物种中，松果体细胞类型常日聚拢成两个分支。在斑马鱼松果体中，一个分支由锥状细胞、神经元和杆状细胞组成，而另一个分支则由三个子分支组成。在大鼠松果体中，两个亚类的松果体细胞聚拢在一个分支中。猴的树状图包括小胶质细胞、松果体细胞和少突胶质细胞的两个亚类。在斑马鱼中，VLMC、Müller样神经胶质细胞和RPE样细胞被分为一个分支，而在大鼠和猴中，VLMC和星形胶质细胞聚拢在一起。这些结果突出了不同物种松果体中细胞类型聚拢的不同模式。
图1.在单细胞分辨率下，三个物种松果体细胞组成的特色。（A） 三个物种的进化树和松果体的解剖位置。（B）本研究中运用的剖析示意图。（C-E）tSNE图描述了从斑马鱼（C）、大鼠（D）和猴（E）在白天的单细胞转录组中鉴定的紧张松果体细胞类型。顶部条形图表示每个物种的细胞类型组成。（F-H）点图显示了斑马鱼（F）、大鼠（G）和猴（H）的前4个标记基因表达水平。颜色强度表示均匀表达，点大小反响了表达相应基因的细胞比例。利用每种细胞类型的前20个标记天生聚类树状图。
1.2 松果体细胞类型的进化守旧性及其跨物种的光转导转录表达
在对不同物种松果体的细胞身分和细胞类型聚拢模式进行表征后，研究职员将着重于这些细胞类型的进化守旧性。详细而言，研究职员试图研究不同细胞类型在白天的物种间守旧性，特殊关注感光细胞及其转录组特色在进化谱系中的守旧性。为理解决这一问题，研究职员在25291个斑马鱼基因、17024个大鼠基因和17781个猴基因中统共鉴定了15655个重叠基因，阐明了93.8%的物种均匀变异（图2A）。随后，研究职员对这三个物种的细胞类型成对干系性剖析显示了四个不同的分支（图2B）。斑马鱼感光细胞和神经元与哺乳动物松果体细胞和少突胶质细胞干系，而斑马鱼RPE样细胞和Müller样胶质细胞与哺乳动物星形胶质细胞聚拢。别的分支包括哺乳动物小胶质细胞和循环细胞，以及所有物种中存在的内皮细胞和VLMC。在tSNE剖析的支持下，这些结果证明了不同物种松果体细胞类型的守旧性。
此外，研究职员对有助于细胞谱系相似性的基因簇进行了功能富集剖析（图2C）。斑马鱼感光细胞和哺乳动物松果体细胞之间共享的基因紧张与视觉光转导和突触旗子暗记通路有关（图2C）。研究职员还创造，斑马鱼神经胶质细胞和哺乳动物星形胶质细胞之间的共享基因紧张与视觉光转导和胶质天生有关，这表明它们在调节昼夜节律中发挥着重要浸染。这些创造强调了视觉光转导在坚持不同物种松果体细胞类型之间相似性方面的关键浸染（图2C）。
为了进一步研究不同物种光转导基因的转录特色，研究职员从已揭橥的文献中网络了101个斑马鱼基因，并在大鼠和猴等分别鉴定了48个和41个同源基因（图2D）。根据筛选标准，研究职员在斑马鱼感光细胞、RPE样和Müller样神经胶质细胞中鉴定了40个基因，这些基因覆盖了全体光转导过程（图2E）。相反，研究职员在哺乳动物松果体细胞和星形胶质细胞中鉴定了21个大鼠基因和15个猴基因（图2E）。值得把稳的是，一些基因在大鼠和猴中都有表达，包括转导蛋白（Gngt1、Gnb3、Gngt2）、磷酸二酯蛋白（Pdc）、磷酸二酯酶6（Pde6d）、GTPase（Rgs9）、GC激活（Guca1a）和Ca2+干系（Calm2、Cacna1f和Cdhr1）基因。这与之前的研究结果同等，即一些光转导基因在哺乳动物松果体细胞中表达。此外，一些基因，如斑马鱼guca1a、pde6ga和rgs9a，以及大鼠Sag、guca1a和Calms3，在夜间高度表达，表明它们在光勾引的昼夜节律调节中发挥着重要浸染。总之，这些结果在单细胞水平上为光转导基因的跨物种转录图谱供应了新的见地。
图2.三个物种中松果体细胞类型的守旧性和光转导路子的多样性。（A） 物种间同源基因。（B） 干系热图显示了不同物种松果体转录谱的总体守旧性。细胞谱系通过层次聚类进行聚类。利用富集标记基因打算成对干系性。颜色强度表示成对聚类的干系性。（C） 利用Metascape对细胞谱系相似性的基因进行功能富集剖析。（D） 脊椎动物中光转导级联的示意图。列出了斑马鱼的光转导基因。在光转导过程中，光激活的视蛋白激活由三个亚基（α、β和γ）组成的转导蛋白。转导蛋白反过来激活磷酸二酯酶6（PDE），导致与α和β（或两个α亚基）形成二聚体。活化的PDE启动cGMP水解为GMP。环核苷酸离子通道（CNG）是一种具有α和β亚基的四聚体构造的蛋白，其开放状态由cGMP坚持。在GC激活蛋白（GCAP）的调节浸染下，鸟苷酸环化酶（GC）介导cGMP的后续合成。视蛋白激酶（GRK）通过磷酸化润色视蛋白，使其失落去活性，这是一个由回收蛋白的过程。接下来，抑制蛋白arrestin与磷酸化视蛋白相互浸染，并抑制其向G蛋白的旗子暗记传导。（E）点图描述了不同细胞类型的光转导基因的均匀表达：斑马鱼的感光细胞和支持神经胶质细胞、松果体细胞，以及哺乳动物（大鼠和猴）中的星形胶质细胞。
1.3 不同物种松果体和视网膜之间的转录相似性
在剖析了松果体细胞类型及其光转导转录组后，研究职员进一步磋商了松果体和视网膜之间在白天的转录关系。在脊椎动物中，松果体细胞与视网膜感光细胞具有相似的特色，特殊是光转导基因的表达。对此研究职员进行比较剖析，以在单细胞水平上阐明这两种组织之间细胞类型的进化和功能相互浸染。为此，研究职员首先网络了这三个物种的白天视网膜数据集，并对细胞簇进行了表征。总体而言，研究职员在三种视网膜中鉴定了六个细胞簇，包括感光细胞（视锥细胞和视杆细胞）、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞（RGC）、水平细胞和神经胶质细胞（Müller神经胶质细胞、RPE细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞）（图3A-C）。
为了进一步检讨松果体和视网膜之间的相似性，研究职员打算了每个物种内细胞类型的成对干系性（图3D-F）。研究职员在斑马鱼的松果体和视网膜之间鉴定了三对相似的细胞类型：感光细胞匹配的锥状和杆状细胞、神经元匹配的RGC细胞和神经胶质细胞匹配的神经胶质细胞。在大鼠和猴身上也不雅观察到了类似的模式。
研究职员剖析了导致松果体和视网膜相似性的共享基因家族。在斑马鱼中，感光细胞中的重叠基因在与光转导、视觉感知和感光细胞分解干系的路子中富集（图3G）。与图2E中的创造同等，松果体细胞和视网膜感光细胞的共享哺乳动物基因在涉及视觉感知、感光细胞坚持和光刺激的觉得感知路子中富集（图3H，I）。图中标记并强调了斑马鱼（36个基因）、大鼠（18个基因）和猴（17个基因）在这些路子中富集的基因（图3G-I）。值得把稳的是，个中几个基因显示出与光转导干系。在大鼠中，这些基因包括Cnga1、Cngb1、Gnb3、Gngt1、Gngt2、Guca1a、Guca1b和Rgs9。在猴中，干系基由于CNGB1、GNB5、GRK7和GUCA1C。
研究职员还研究了松果体神经胶质细胞和视网膜神经胶质细胞之间的重叠基因（图3J-M）。在斑马鱼中，松果体RPE样细胞和视网膜RPE细胞的共享基因簇在范例的类视黄醇循环路子中富集。同时，Müller样神经胶质细胞和Müller神经胶质细胞簇富含与核受体和组织再生干系的旗子暗记通路（图3J，K）。在哺乳动物中，星形胶质细胞和视网膜Müller胶质细胞的共享基因簇在与胶质天生、觉得器官发育和节律过程干系的路子中富集（图3L，M），与图2C中的创造同等。这些结果表明，哺乳动物的星形胶质细胞可能在调节松果体的昼夜节律中发挥浸染。
图3.三个物种松果体和视网膜的单细胞转录特色比较。（A-C）tSNE图显示了从斑马鱼（A）、大鼠（B）和猴（C）的单细胞转录组中鉴定的视网膜的紧张细胞类型。（D-F）热图显示斑马鱼（D）、大鼠（E）和猴（F）松果体和视网膜细胞类型转录谱的总体守旧性。x轴代表视网膜中的细胞类型，而y轴代表松果体的细胞类型。颜色强度表示成对聚类的干系性。（G-I）Venn图显示了斑马鱼（G）、大鼠（H）和猴（I）的松果体感光细胞/松果体细胞（灰色）和视网膜感光细胞（橙色）之间重叠的富集标记基因。热图显示了这些基因的富集路子。（J-M）Venn图显示了斑马鱼（J，K）、大鼠（L）和猴（M）的支持性神经胶质细胞的重叠富集标记基因，包括来自松果体和视网膜的Müller样神经胶质细胞、RPE样细胞和星形胶质细胞。热图显示了这些基因的富集路子。
2 松果体细胞在褪黑素合成中的浸染
在探索松果体细胞的进化和光敏性之后，研究职员现在将把稳力转向功能意义。褪黑素在昼夜节律调节中起着核心浸染。褪黑素产生的繁芜性以及参与这一过程的特定松果体细胞，因物种而异。
2.1 褪黑素的合成和跨物种的昼夜节律基因表达
考虑到光刺激的昼夜节律对脊椎动物松果体褪黑素生物合成和开释的影响，研究职员评估了这些单细胞数据集中与褪黑素合成和昼夜节律干系的基因簇的表达模式。最初，研究职员剖析了单细胞数据，并不雅观察到斑马鱼中褪黑素合成干系基因（包括tph1a、tph2、ddc、aanat2和asmt）的高表达，而哺乳动物中tph2（TPH2）和Aanat（AANAT）的表达水平较低（图4A）。这些转录本在斑马鱼的杆状和锥形感光细胞以及哺乳动物的松果体细胞中最为突出。然而，在剖析夜间的RNA-seq数据集时，在所有三个物种中都不雅观察到褪黑素合成基因表达的显著变革。这些结果强调了昼夜节律在松果体遗传调控中的主要性。
接下来，研究职员在斑马鱼中选择了一组38个昼夜节律干系基因，在哺乳动物（大鼠和猴）中选择了25个。研究职员不雅观察到斑马鱼基因tefa和csnk1a1在白天的所有松果体细胞类型中都高表达。根据先前的宣布，光通过斑马鱼松果体细胞的昼夜节律时钟勾引tefa、cry1aa、per2和bhlhel41的表达（图4B）。在哺乳动物中，高表达的基因包括Per3（PER3）、Csnk1a1（CSNK1A1）、Dbp、Kpnb1（KPNB1）和RORA，表现出比斑马鱼更多的多样性。由于严格的过滤标准，在哺乳动物细胞中未不雅观察到Tefa。研究结果证明了昼夜节律干系基因表达的显著昼夜变革，并阐明了斑马鱼和哺乳动物之间昼夜节律影响的差异。
研究职员利用单细胞数据，进一步探索了涉及褪黑素合成、昼夜节律和光转导的基因共表达网络（图4C）。斑马鱼表现出有限的昼夜节律调节干系基因的相互浸染（图4D-F），而哺乳动物表现出更广泛的网络（图4G-J）。例如，Dbp与大鼠星形胶质细胞中的10个其他基因相互浸染，KDM5A在猴松果体细胞中显示出10个相互浸染。此外，三个物种的共表达网络也有所不同。相互浸染程度最高的前五个基因包括：斑马鱼的asmt、gngt1、excoh、tph2、gnat2（图4D-F）；大鼠的Asmt、Tph1、Pdc、Cngb1和Gnb3（图4G、H）；猴的TPH1、GNGT1、DDC、GUCA1A和CDHR1（图4I，J）。总的来说，研究职员基于算法的共表达预测与之前的结果同等，揭示了斑马鱼中光转导干系基因（excoh、cnga1和pde6g）和褪黑素合成干系基因（tph2、asmt、ddc和aaat2）之间的遗传关联。研究职员还表征了夜间大鼠的基因共表达网络，个中Aanat和Asmt在网络剖析中脱颖而出。
图4.三个物种褪黑素合成、昼夜节律和光转导干系基因的表达异质性。（A） 小提琴图描述了三个物种褪黑素合成干系基因的表达水平。x轴代表松果体细胞类型，而y轴代表每个基因的表达水平。百分比表示在每种细胞类型中表达特定基因的细胞的比例。（B） 显示三个物种昼夜节律干系基因在白天表达的点图。x轴代表松果体细胞类型，y轴代表基因均匀表达水平。点的大小对应于每种细胞类型中表达该基因的细胞的比例。（C） 非哺乳动物松果体和哺乳动物松果体中掌握褪黑素昼夜节律的关键身分的示意图。（D-F）基于单细胞数据集，参与调节斑马鱼感光细胞细胞（D）、RPE样细胞（E）和Müller神经胶质细胞（F）昼夜节律（绿色）、褪黑素合成（灰色）和光转导（棕色）的基因共表达网络。（G-H）基于单细胞数据集，大鼠松果体细胞（G）和星形胶质细胞（H）中参与昼夜节律（绿色）、褪黑素合成（灰色）和光转导（棕色）的基因的共表达网络。（I-J）基于单细胞数据集，参与调节猴松果体细胞（I）和星形胶质细胞（J）昼夜节律（绿色）、褪黑素合成（灰色）和光转导（棕色）的基因的共表达网络。点的大小表示程度，线宽反响了表达的干系性。
2.2 松果体细胞中配体-受体的通讯影响褪黑素的合成
在深入剖析与褪黑素合成和昼夜节律干系的基因表达模式的根本上，研究职员将重点转移到松果体器官内繁芜的细胞相互浸染上，这对褪黑素的产生至关主要。先前宣布了松果体细胞和星形胶质细胞之间褪黑素合成的潜在负反馈机制。为了更好地理解松果体器官内的通信模式，研究职员研究了斑马鱼（感光细胞、RPE样细胞和Müller样胶质细胞）和哺乳动物（松果体细胞和星形胶质细胞）在白天特定细胞簇内的配体-受体对。研究职员利用弦图来可视化不同细胞群体之间的总体相互浸染。在斑马鱼中，RPE样和Müller样神经胶质细胞中的配体紧张靶向相应细胞类型中的受体，而感光细胞中的配体则紧张靶向感光受体（图5A）。在大鼠和猴中，星形胶质细胞和松果体细胞之间相互浸染（图5B，C）。
详细而言，在斑马鱼中，神经胶质细胞表达配体mdka和mdkb，其靶向表达Sdc4受体的感光细胞（图5D）。在大鼠中，神经胶质细胞呈现配体Mdk和Ptn，它们与表达Sdc2、Sdc4和Ncl受体的松果体细胞相互浸染（图5E）。在猴中，神经胶质细胞紧张表达配体PTN，浸染于SDC2和ALK受体靶向松果体细胞（图5F）。值得把稳的是，视黄酸可以通过影响AANAT的活性来调节褪黑素的合成。此外，与MDK功能相似的PTN也可能调节褪黑素的合成，由于MDK的表达对视黄酸有反应。
此外，研究结果强调了GPCR在细胞-细胞相互浸染中的浸染。在斑马鱼中，感光细胞衍生的Mif配体靶向神经胶质细胞中的ackr3a和ackr3b。在猴中，松果体细胞衍生的PSAP配体靶向星形细胞GPR37和GPR37L1。在感光细胞、松果体细胞和神经胶质细胞之间不雅观察到繁芜的物种特异性通信模式，这些模式与褪黑素合成等过程有关。
图5.不同物种松果体中不同的配体-受体对。（A）弦图显示了斑马鱼松果体内感光细胞（蓝色）、RPE样细胞（绿色）和Müller样神经胶质细胞（粉色）之间的配体-受体对。（B）弦图显示了大鼠松果体内松果体细胞（蓝色）和星形胶质细胞（粉赤色）之间的配体-受体对。（C） 弦图显示了猴松果体内松果体细胞（蓝色）和星形胶质细胞（粉赤色）之间的配体-受体对。外圈表示配体，内圈表示相应的受体。内圈的颜色与受体的颜色相匹配，连接的颜色与配体相对应。（D-F）图示斑马鱼（D）、大鼠（E）和猴（F）松果体中特定细胞群内配体-受体对相互浸染的点图。x轴代表从配体到受体的细胞类型，而y轴代表相应的配体-受体对。
3 松果体旗子暗记转导的进化见地
基于对松果体细胞进化及其在褪黑素合成中的浸染的理解，研究职员进一步剖析掌握这些过程的潜在机制。研究职员磋商了这些繁芜的机制，包括GPCR的多样性以及这三个物种松果体内的转录调控，揭示了它们如何影响松果体功能和多样性。
3.1 松果体GPCR多样性：在褪黑素产生中的浸染以及与视网膜GPCR的进化相似性
GPCR在脊椎动物褪黑素的产生中起着核心浸染。在这项研究中，研究职员在三个物种的松果体中确定了117个共享的GPCR（图6A）。此外，研究职员创造松果体内的紧张GPCR家族属于A类视紫红质样GPCR（图6B）。此外，参与GPCR级联的磷脂酶C激活和GPCR旗子暗记的腺苷酸环化酶调节的关键旗子暗记通路在GPCR介导的旗子暗记转导中至关主要（图6B）。
接下来，研究职员剖析了每个物种松果体中的细胞谱系特异性GPCR家族（图6C-E）。研究职员不雅观察到斑马鱼感光细胞、Müller样神经胶质细胞和RPE样细胞紧张表达A类（视紫红质）基因。有趣的是，opn1lw2、opn1lw1、exoh、rgra和rgrb等基因是感光路子的核心，表明它们在斑马鱼松果体中折衷光子相应性褪黑素合成机制中的浸染。相反，哺乳动物表现出不同的GPCR特色，表明褪黑素合成的调节不同。大鼠和猴星形胶质细胞分别表达9和12个A类GPCR。共享的表达基因包括A类基因（Ednrb、Ogfrl1、Adora2b）和其他GPCR（Adcyap1r1、Celsr2、Smo、Gprc5b、Gabbr1）。大鼠松果体细胞由A类基因（Adra1b和Sstr3）和其他GPCR（Tm2d1、Celsr3和Fzd4）标记。猴松果体细胞表现出A类ADRA1B和其他家族（PTGER3、CRHR2、GLP1R和ADGRG4）的表达。值得把稳的是，与去甲肾上腺素（NE）介导的松果体旗子暗记传导干系的Adra1b的表达，在大鼠昼夜节律中起着至关主要的浸染，进一步突出了不同物种褪黑素调节路子的变革。已有宣布显示α1b和β1肾上腺素受体在去甲肾上腺素调节松果体中的关键浸染。详细而言，虽然β1-肾上腺素能受体的激活对腺苷酸环化酶的激活至关主要，但α1-肾上腺素能受体起到了放大这种浸染的浸染。然而，只管Adrb1具有主要意义，但由于研究职员的GPCR多样性剖析标准，它并不是研究职员研究的紧张焦点。
鉴于松果体和视网膜之间的内在功能关系，理解松果体中表达的GPCR是否与视网膜中的GPCR同步进化至关主要。研究职员利用单细胞剖析，深入研究了各种视网膜细胞类型中GPCR的表达模式（图6F-H）。在斑马鱼松果体和视网膜中不雅观察到光转导干系GPCR（opn1lw2、opn1lw1、rgra和rgrb）的重叠，强调了图3G-I中所示的结果。有趣的是，哺乳动物视网膜中的GPCR表现出组织特异性，个中Opn1mw在大鼠视锥细胞中特异表达，OPN1LW在猴视锥细胞内特异表达，Rho（RHO）在这两种细胞的杆状细胞内均特异表达。值得把稳的是，α-1肾上腺素能受体（Adra1b）在松果体细胞和视网膜感光细胞中都表现出高表达。此外，Ednrb、Adora2b、Celsr2、Gabbr1和Smo被创造在松果体和视网膜星形胶质细胞之间共享。这些见地强调了GPCR在不同物种的松果体和视网膜中潜在的进化相似性和共同的功能浸染。
图6.不同物种松果体和视网膜中的细胞类型特异性GPCR。（A）Venn图显示了单细胞数据集中在三个物种的松果体中鉴定的GPCR的重叠。（B） 条形图显示了三个物种之间重叠GPCR的富集路子。（C-E）热图显示斑马鱼（C）、大鼠（D）和猴（E）松果体中细胞类型特异性GPCR。（F-H）热图显示来自斑马鱼（F）、大鼠（G）和猴（H）单细胞数据的视网膜中细胞类型特异性GPCR。颜色强度表示每个GPCR的相对表达。
3.2 松果体功能和物种多样性的转录调控
TF在调节与松果体发育和功能干系的基因表达中起着至关主要的浸染。在这项研究中，研究职员利用单细胞剖析在三个物种中统共鉴定了607个细胞谱系特异性转录因子。这些TF紧张富集于神经系统发育、觉得器官发育、基因表达的昼夜节律掌握以及转录和细胞内旗子暗记通路。研究职员创造，在三个物种的感光细胞（松果体细胞）中，共享的TF掌握觉得器官发育和昼夜节律基因表达（图7A-C）。胶质细胞也表现出守旧的转录调控，id1、id2a和id3的表达在三个物种中共享。相反，感光细胞（松果体细胞）中的TF是特异性的，包括斑马鱼的ascl1a和rx1，大鼠的Arid1a、Arid4a、Dbp、Mef2c，以及猴的AKNA、ARID2、MEIS1。值得把稳的是，斑马鱼RPE样细胞表达独特的转录因子，如nr2e3、otx5和tbx2b。在斑马鱼感光细胞中，前五个相互浸染的TF（rx1、insm1a、neurod1、tulp1a、lhx4）形成了一个包括褪黑素合成、光转导和GPCR的遗传网络（图7D）。哺乳动物松果体细胞显示出不同的相互浸染TF，每个网络包括褪黑素合成（Asmt、Tph1、DDC）、光转导（Gngt1、Gngt2（GNGT2）、GNB1、Gnb3（GNB3））和其另日夜节律基因（Dbp、Kpnb1、Kdm5a（KDM5A）、CSNK1A1、CREBBP）（图7E、F）。在神经胶质细胞中，研究职员为每个物种鉴定了不同的高度连接的TF网络（图7G-I）。有趣的是，与松果体细胞比较，研究职员不雅观察到神经胶质细胞GPCR网络中的连接水平相对较高，包括ackr3b、grm2b、Gabbr1、Ogfrl1、ADCYAP1R1和GPR37L1（图7G-I）。
此外，研究职员对大鼠松果体的夜间单细胞数据集进行了详细剖析，揭示了松果体细胞和神经胶质细胞之间的不同模式。总之，研究职员的创造揭示了TF在介导三个物种松果体内的基因表达和功能多样性中的关键浸染。
图7.不同物种松果体中转录因子的调控网络。（A-C）热图显示了来自单细胞数据集的斑马鱼（A）、大鼠（B）和猴（C）中与昼夜节律路子干系的细胞类型特异性转录因子。颜色强度反响了每个TF的相对表达。（D-F）单细胞数据集的斑马鱼感光细胞（D）、大鼠松果体细胞（E）和猴子松果体细胞（F）的TF（粉赤色）、GPCR（浅蓝色）和参与昼夜节律（绿色）、褪黑素合成（灰色）和光转导（棕色）的基因之间的基因共表达网络。（G-I）单细胞数据集的斑马鱼RPE样细胞（G）、大鼠星形胶质细胞（H）和猴星形胶质细胞（I）中TF（粉赤色）、GPCR（浅蓝色）和参与昼夜节律（绿色）、褪黑素合成（灰色）和光转导（棕色）的基因之间的基因共表达网络。
谈论
脊椎动物的松果体是褪黑素生物合成和分泌的紧张场所，褪黑素是一种以昼夜节律驱动的韶光变革而有名的激素。本研究通过全面和比较的单细胞转录组学剖析，阐明了松果体细胞的进化及其光敏能力、松果体细胞在褪黑素合成中的浸染，以及斑马鱼、大鼠和猴松果体内的旗子暗记转导路子。研究职员的创造为这些脊椎动物褪黑素产生和分泌的不同调节供应了新的见地。
根据不同物种在白天的单细胞数据，这些物种的细胞组成多样性和光转导干系基因的表达与松果体的功能转换和进化适应密切干系。在斑马鱼中，感光细胞约占松果体的70%，而RPE样细胞和Müller样胶质细胞分别仅占15%和8%。值得把稳的是，这些感光细胞表达了一系列覆盖全体光转导路子的光敏基因，证明了它们在斑马鱼体内光子传感中的直接浸染。此外，RPE样和Müller样神经胶质细胞表现出光转导干系基因的表达，包括exoh、saga、pde6h、gngt1和gnat1，表明它们可能参与光感想熏染。有趣的是，RPE样细胞也在松果体的类视黄醇循环中发挥浸染，而表达Agrp2的RPE类细胞对斑马鱼的感光细胞活力和黑素细胞干系背景适应至关主要。这些创造共同表明，松果体中的胶质细胞可能在昼夜节律的调节中发挥浸染，须要进一步的实验验证。相反，哺乳动物的松果体紧张由松果体细胞组成，大鼠约占85%，猴约占95%；星形胶质细胞占较小比例，大鼠和猴约占7%和2%。这些哺乳动物的松果体细胞已经失落去了直接感知光的能力，转而依赖视网膜来检测光子，这一过程由视黄醇-下丘脑介导。有趣的是，哺乳动物松果体细胞和斑马鱼感光细胞表现出显著的细胞相似性，特殊是在与光转导路子干系的基因的共同表达方面。这一不雅观察结果支持了哺乳动物松果体细胞可能是从原始感光细胞细胞进化而来的假设。此外，哺乳动物松果体中转导蛋白（Gngt1、Gnb3、Gngt2）和光感想熏染蛋白（Pdc）等光敏基因的存在，扩展了早期创造的这些对光不敏感的哺乳动物松果体的光转导基因表达。另一方面，哺乳动物星形胶质细胞显示出与斑马鱼RPE样和Müller样神经胶质细胞的干系性，共享视觉光转导干系基因。这种干系性表明，哺乳动物星形胶质细胞可能是由类似RPE或Müller样神经胶质细胞的前体进化而来。
在这项研究中，研究职员还探索了褪黑素合成的初始步骤，即色氨酸通过色氨酸羟化酶（TPH）羟基化为5-羟基色氨酸。研究职员的数据显示，tph1a和tph2在斑马鱼感光细胞中的高表达，在白天时，tph1b的表达可忽略不计。这与先前的宣布同等，表明在幼虫发育过程中，tph1b紧张存在于腹侧间脑的视前区域。相反，哺乳动物松果体细胞在白天表现出Tph1的高表达和Tph2的低表达。Tph2紧张在脑干中缝核中表达。这些结果表明，斑马鱼和哺乳动物都利用tph1（TPH1）将色氨酸羟基化为5-羟基色氨酸，而斑马鱼还利用Tph2。
褪黑素的合成受到与光转导和昼夜节律干系的路子的影响。CSNK1A1卖力磷酸化所有物种中表达的时钟基因PER和CRY，解释了其进化守旧的浸染。然而，在基因簇中存在某些物种特异性差异。例如，转录因子tefa（一种分子时钟基因）在斑马鱼中大量表达，但在哺乳动物中表达最低。斑马鱼同时具有tefa和tefb，两者都与昼夜节律光反应路子有关。相反，与昼夜节律干系的基因Dbp和Kpnb1在大鼠中表现出高表达，Kpnb1也在猴松果体中普遍存在。Dbp在与基因的D-box区结合中发挥浸染，这对中枢时钟至关主要，而KPNB1与PER蛋白相互浸染，并辅导PER/CRY的核转运。基于单细胞数据，斑马鱼的光转导和褪黑素合成干系基因之间存在显著的相互浸染，这表明光暴露可能直接影响褪黑素的产生。然而，在大鼠和猴中，基因共表达网络强调昼夜节律和光转导路子之间更明显的相互浸染。
研究职员的剖析强化了松果体和视网膜之间共享进化谱系，光转导干系基因和GPCR在白天的表达证明了这一点。详细而言，研究职员确定了36个与斑马鱼松果体和视网膜之间的视觉感知干系的共享基因，强调了它们的感光特性。这一创造与先前的研究同等，表明斑马鱼松果体中存在完全的光转导路子。然而，只管哺乳动物松果体细胞确实表达某些光转导基因，但由于缺少关键的视蛋白，它们的松果体对光不敏感。在斑马鱼中，松果体和视网膜都表达GPCR，如opn1lw2和opn1lw1，它们转录视蛋白以进行长波长光吸收。此外，斑马鱼视网膜表达rho和rhol，而松果体独特地表达exoh，为其松果体特异性浸染供应了进一步的证据。相反，哺乳动物表现出不同的GPCR表达模式。例如，Opn1mw（OPN1LW）存在于大鼠和猴的锥细胞中，Rho（RHO）存在于这两种物种的杆状细胞中。
松果体中的旗子暗记转导受到GPCR和TF的繁芜调控，在褪黑素合成和感光细胞中发挥着关键浸染。ADRA1B基因是去甲肾上腺素旗子暗记传导的核心参与者，在哺乳动物松果体细胞和视网膜感光细胞中都表现出共同表达，暗示着守旧的调节功能。在视网膜中，ADRA1B通过掌握cAMP水平和调节在肾上腺素存在的情形下参与视锥光反应的蛋白来掌握光适应。去甲肾上腺素在松果体中发挥紧张调节浸染，通过一种涉及α1b和β1肾上腺素受体的联合机制来刺激腺苷酸环化酶，终极提高环AMP水平。虽然β1-肾上腺素能受体的激活对刺激腺苷酸环化酶至关主要，但α1b肾上腺素能受体通过钙离子（Ca2+）和磷脂酰肌醇（Pi）激活蛋白激酶C来增强这种浸染。由此产生的由肾上腺素受体驱动的环腺苷酸的增加激活了蛋白激酶A。这种酶随后磷酸化环腺苷酶反应元件结合蛋白，启动基因转录。Adrb1对AANAT转录激活至关主要，Adrb1和Adra1b的同步峰值表明松果体中存在折衷的去甲肾上腺素调节。考虑到本研究的大鼠单个数据来自RP19，这阐明了不雅观察到的Adrb1的低表达百分比。值得把稳的是，转录因子rx1在斑马鱼感光细胞中显著表达，但在哺乳动物松果体细胞中险些无法检测到，它与光转导基因如gngt2a、gnat2和guca1a显著相互浸染。这种相互浸染强调了rx1在斑马鱼松果体光感想熏染中的关键浸染。
总之，本研究紧张集中在三种脊椎动物上，这限定了研究职员对所有脊椎动物松果体进化的理解。此外，不同测序技能的运用，包括斑马鱼和大鼠的scRNA-seq和猴的snRNA-seq，可能会带来一些技能变异。然而，这些局限性并没有影响紧张创造的主要性和从这项研究中得出的有力结论。
